Beherrschung der Bradford Protein Assay Berechnung für eine genaue Proteinquantifizierung
Formel:proteinConcentration = (Absorbanz - Schnittstelle) / Steigung
Einführung in die Berechnung des Bradford Protein Assays
Die Bradford Proteinbestimmung ist ein schnelles und genaues Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Proteinen in einer Lösung. Diese Technik basiert auf der Bindung des Coomassie Brilliant Blau Farbstoffs an Proteine, was zu einer Farbänderung führt, die mit einem Spektralphotometer gemessen werden kann. Der Grad der Farbänderung ist direkt proportional zur Protein concentration.
Verstehen der Formel
Die Formel zur Berechnung der Proteinkonzentration lautet:
proteinConcentration = (Absorbanz - Schnittstelle) / Steigung- AbsorbanzDer bei 595 nm mit einem Spektralphotometer gemessene Absorptionswert.
- abfangenDer y-Achsenabschnitt der Standardkurve, die während des Assays erstellt wurde, typischerweise erhalten durch eine lineare Regressionsanalyse.
- HangDie Steigung der Standardkurve, die ebenfalls aus der linearen Regressionsanalyse gewonnen wurde.
Das Ergebnis, proteinKoncentrationwird in Mikrogramm pro Milliliter (µg/mL) ausgedrückt.
Beispielrechnung
Lass uns ein Beispiel durchgehen, um zu sehen, wie die Berechnung in der Praxis funktioniert:
- Angenommen, wir haben die folgenden Daten aus einem abgeschlossenen Bradford Proteinassay:
Absorbanz= 0,75abfangen= 0.1Hang= 1,5
Mit der Formel können wir die Proteinkonzentration berechnen:
proteinKoncentration = (0.75 - 0.1) / 1.5Das ergibt:
proteinConcentration = 0.43 µg/mL.Echtweltbeispiel
Berücksichtigen Sie ein Forschungslabor, in dem Wissenschaftler daran arbeiten, die Menge an Protein in verschiedenen Zelllysaten zu quantifizieren. Sie führen einen Bradford Proteinassay durch und stellen fest, dass die Absorbanz einer ihrer Proben 0,65 beträgt. Aus früheren Experimenten wissen sie, dass der Achsenabschnitt 0,08 und die Steigung 1,4 beträgt. Wenn wir diese Werte in unsere Formel einsetzen:
proteinConcentration = (0.65 - 0.08) / 1.4Das ergibt:
Protein Konzentration = 0,41 µg/mL.Diese schnelle und genaue Messung hilft den Forschern, mit ihren Experimenten fortzufahren und sicherzustellen, dass sie mit den richtigen Protein Konzentrationen arbeiten.
Häufige Probleme und Fehlerbehandlung
Es gibt einige häufige Probleme, die beim Durchführen eines Bradford Protein Assays auftreten können:
- Falsche Generierung der StandardkurveStellen Sie sicher, dass Sie Ihre Standards genau vorbereiten und messen.
- Interferenzen durch andere SubstanzenSeien Sie vorsichtig bei Substanzen, die den Test beeinträchtigen können, wie zum Beispiel Reinigungsmittel.
- MessfehlerStellen Sie sicher, dass das Spektrophotometer ordnungsgemäß kalibriert und funktionstüchtig ist.
Häufig gestellte Fragen (FAQs)
Q: Was ist, wenn mein Absorptionswert außerhalb des Bereichs der Standardkurve liegt?
Verdünnen Sie Ihre Probe, sodass ihre Absorbanz im Bereich der Standardkurve liegt, und berechnen Sie dann die Konzentration neu.
F: Kann ich eine andere Wellenlänge für den Bradford Assay verwenden?
A: Der Bradford Protein Assay ist speziell darauf ausgelegt, die Absorption bei 595 nm zu messen. Die Verwendung einer anderen Wellenlänge kann zu ungenauen Ergebnissen führen.
Q: Wie stelle ich die Genauigkeit meiner Standardkurve sicher?
Bereiten Sie bei jedem Test frische Standards vor und messen Sie diese genau. Verwenden Sie mehrere Wiederholungen und berechnen Sie den Durchschnitt der Ergebnisse.
Tags: Biochemie