Pemahaman perhitungan uji protein Bradford untuk kuantifikasi protein yang akurat

Pengantar Perhitungan Assay Protein Bradford

Uji Protein Bradford adalah metode cepat dan akurat untuk menentukan konsentrasi protein dalam larutan. Teknik ini didasarkan pada ikatan pewarna Coomassie Brilliant Blue dengan protein, yang menyebabkan perubahan warna yang dapat diukur menggunakan spektrofotometer. Derajat perubahan warna berbanding lurus dengan konsentrasi protein.

Memahami Rumus

Rumus yang digunakan untuk menghitung konsentrasi protein adalah:

• serapanNilai absorbansi yang diukur pada 595 nm menggunakan spektrofotometer.
• mengintersepIntersep-y dari kurva standar yang dihasilkan selama pengujian, biasanya diperoleh dari analisis regresi linier.
• lerengKemiringan kurva standar, juga diperoleh dari analisis regresi linier.

Hasil, konsentrasiProteindiekspresikan dalam mikrogram per mililiter (µg/mL).

Contoh Perhitungan

Mari kita melalui contoh untuk melihat bagaimana perhitungan bekerja dalam praktik:

• Misalkan kita memiliki data berikut dari Assay Protein Bradford yang telah selesai:
• serapan = 0,75
• mengintersep = 0,1
• lereng = 1.5

Menggunakan rumus, kita dapat menghitung konsentrasi protein:

Ini menghasilkan:

Contoh Kehidupan Nyata

Pertimbangkan sebuah laboratorium penelitian di mana para ilmuwan bekerja untuk mengukur jumlah protein dalam berbagai lisat sel. Mereka melakukan Uji Protein Bradford dan menemukan absorbansi salah satu sampel mereka adalah 0,65. Dari eksperimen sebelumnya, mereka tahu bahwa intersepnya adalah 0,08 dan kemiringannya adalah 1,4. Memasukkan nilai nilai ini ke dalam rumus kita:

Ini menghasilkan:

Pengukuran cepat dan akurat ini membantu para peneliti melanjutkan eksperimen mereka, memastikan bahwa mereka bekerja dengan konsentrasi protein yang benar.

Masalah Umum dan Penanganan Kesalahan

Ada beberapa masalah umum yang dapat muncul saat melakukan Uji Protein Bradford:

• Generasi kurva standar yang salahPastikan Anda mempersiapkan dan mengukur standar Anda dengan akurat.
• Interferensi oleh zat lainPerhatikan zat zat yang dapat mengganggu uji, seperti deterjen.
• Kesalahan pengukuranPastikan bahwa spektrofotometer dikalibrasi dengan benar dan berfungsi dengan baik.

Pertanyaan yang Sering Diajukan (FAQ)

T: Apa yang harus saya lakukan jika nilai absorbansi saya berada di luar jangkauan kurva standar?

Cairkan sampel Anda sehingga absorbansinya berada dalam rentang kurva standar dan kemudian hitung kembali konsentrasinya.

T: Bisakah saya menggunakan panjang gelombang yang berbeda untuk Uji Bradford?

A: Uji Protein Bradford dirancang khusus untuk mengukur absorpsi pada 595 nm. Menggunakan panjang gelombang yang berbeda dapat menyebabkan hasil yang tidak akurat.

Q: Bagaimana cara memastikan akurasi kurva standar saya?

A: Siapkan standar segar setiap kali Anda melakukan uji dan ukur dengan akurat. Gunakan beberapa replikasi dan rata ratakan hasilnya.