Compreendendo a equação do ensaio de proteína de Bradford: um guia abrangente

Compreendendo a equação do ensaio de proteína de Bradford

O ensaio de proteína de Bradford é um procedimento analítico espectroscópico rápido e preciso usado para medir a concentração de proteína em uma solução. Aqui está a análise:

• Cbradford é a concentração da proteína (mg/mL).
• A595 é a leitura de absorbância da amostra a 595 nm.
• Ablank é a leitura de absorbância do blank (sem proteína).
• k é a inclinação derivada da curva padrão (mg/(mL * absorbância)).

Utilizando Parâmetros: Exemplos e Interpretações

Imagine que você tem uma solução de amostra e a colocou em um espectrofotômetro. A absorbância a 595 nm foi registrada em 0,5 e, para o blank, foi 0,1. A inclinação da curva padrão BSA (k) é de 0,2 mg/mL por unidade de absorbância. Colocando isso em nossa equação, a concentração de proteína Cbradford seria calculada da seguinte forma:

Cbradford = (0,5 - 0,1) / 0,2 = 2 mg/mL

Saída:

• Cbradford = a concentração da proteína em mg/mL

Faixa linear e precisão

Tenha em mente que o ensaio de Bradford tem uma faixa linear conhecida (geralmente entre 1-100 µg/mL de proteína). Além dessa faixa, a precisão diminui e os resultados podem ser inconsistentes. Isso significa que a inclinação k deve ser determinada com precisão em uma configuração controlada usando uma proteína padrão, como a albumina sérica bovina (BSA).

Validação de dados e condições experimentais

É essencial ter todos os valores dentro de intervalos apropriados para obter resultados precisos. Desvios, como usar um comprimento de onda diferente de 595 nm, podem distorcer significativamente os resultados.

• Medida A595 - O espectrofotômetro deve ser zerado antes de inserir as amostras.
• Garanta a preparação adequada - Dilua as amostras conforme necessário para colocá-las dentro do intervalo mensurável.

Perguntas frequentes (FAQs)

• P: O que pode interferir nas leituras do ensaio de Bradford?
  R: Detergentes e altos níveis de agentes redutores podem interferir no ensaio. Controles adequados devem ser incluídos para medições precisas.
• P: A curva padrão pode ser reutilizada?
  R: Para confiabilidade, gere uma nova curva padrão toda vez que você realizar o ensaio.

Resumo

A Equação de Ensaio de Proteína de Bradford é uma ferramenta inestimável em bioquímica para determinar a concentração de proteína em uma solução. Fatores críticos a serem considerados incluem geração precisa de curva padrão e medições corretas de absorbância.